1、準(zhǔn)備工作

 

　　在開始任何實驗之前，仔細(xì)閱讀并理解所用熒光探針PCR試劑盒的說明書。不同品牌和類型的試劑盒可能有要求或優(yōu)化條件。確保所有需要的試劑和設(shè)備都已準(zhǔn)備好，包括但不限于模板DNA/RNA、引物、探針、酶混合物、緩沖液以及所需的耗材如PCR管或板。此外，檢查所有儀器是否正常工作，比如熱循環(huán)儀應(yīng)經(jīng)過校準(zhǔn)以保證溫度控制的準(zhǔn)確性。

 

　　2、樣本處理與質(zhì)量控制

 

　　高質(zhì)量的樣本是獲得可靠結(jié)果的基礎(chǔ)。對于RNA樣品，建議先進(jìn)行DNase處理以去除潛在的基因組DNA污染；而對于DNA樣品，則需評估其純度和濃度，通常通過紫外分光光度計測量A260/A280比值來確定。理想的比值應(yīng)在1.8至2.0之間。同時，對樣本進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?，確保PCR反應(yīng)體系中的核酸量處于推薦范圍內(nèi)。

 

　　3、試劑配制與加樣

 

　　按照說明書指示，準(zhǔn)確配制PCR反應(yīng)混合物。這通常涉及將酶、緩沖液、dNTPs、引物和探針等成分按比例混合。注意避免反復(fù)凍融酶制劑，并盡量減少操作時間以防酶活性喪失。使用無菌技術(shù)小心地向每個PCR管或孔中加入適量的反應(yīng)混合物和樣本，確保無氣泡產(chǎn)生且各孔間無交叉污染。使用帶濾芯的移液器吸頭可有效防止這種污染。

 

　　4、運行PCR與數(shù)據(jù)分析

 

　　設(shè)置好熱循環(huán)儀的程序參數(shù)，包括變性、退火和延伸溫度及時長，具體數(shù)值依據(jù)所用引物和目標(biāo)序列特性調(diào)整。啟動PCR后，實時監(jiān)控?zé)晒庑盘栕兓?，記錄Ct值（閾值循環(huán)數(shù)）。Ct值反映了目標(biāo)序列在反應(yīng)中被檢測到的時間點，較低的Ct值表示較高的起始拷貝數(shù)。完成PCR后，利用配套軟件分析數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算未知樣本中的目標(biāo)序列濃度。